Принципово новий перспективний клас біостимуляторів та противірусних препаратів для рослин — гарпінові білки

Гарпінові білки — це клас природних білків, що секретуються грамнегативними фітопатогенними бактеріями. Вони характеризуються високим вмістом гліцину, винятковою термостабільністю та сильною кислотністю — поєднання структурних рис, що робить їх несхожими майже на будь-які інші білки, що зустрічаються в природі.

На відміну від звичайних рослинних поживних речовин або хімічних регуляторів росту рослин, гарпінові білки не постачають поживні речовини рослинам і безпосередньо не регулюють ріст рослин. Натомість вони функціонують як молекулярні сигнали — науковці розглядають їх як «дзвінок пробудження» — що активують вже існуючі шляхи росту та захисту, вже вбудовані в рослину. Після застосування рослини демонструють низку вимірюваних фізіологічних реакцій: покращена ефективність фотосинтезу, підвищена стійкість до хвороб та толерантність до стресу від посухи або екстремальних температур.

Читати також: Перегляд ролі вітаміну С у сільськогосподарських культурах: від антиоксидантної функції до фізіологічного біостимулятора

Важливо, що ці реакції відображають мобілізацію власних прихованих можливостей рослини, а не прямий внесок будь-якої зовнішньої речовини.

З цієї причини гарпінові білки класифікуються як науковою спільнотою, так і агрохімічною промисловістю до категорії біостимуляторів — поряд з гуміновими речовинами, екстрактами морських водоростей та білковими гідролізатами. Однак механізм дії білків гарпіну принципово відрізняється від будь-якого іншого біостимулятора.

Завдяки своєму унікальному механізму дії деякі білки гарпіну також були зареєстровані як біофунгіциди та біонематоциди на таких ринках, як Сполучені Штати, Бразилія та Мексика, де вони використовуються разом зі звичайними фунгіцидами та нематоцидами для досягнення синергетичного ефекту.

Відкриття білків гарпіну

Відкриття білків гарпіну стало результатом неочікуваного відкриття в дослідженнях фітопатології.

У 1992 році дослідницька група Корнельського університету досліджувала патогенез бактеріального опіку — руйнівної бактеріальної хвороби груші та яблуні, спричиненої Erwinia amylovora. Їхньою метою було визначити, як цей патоген завдає шкоди рослинам-господарям.

Під час експерименту вони ввели специфічний білковий екстракт бактерії в листя тютюну. Всупереч очікуванням, рослини не виявляли жодних симптомів хвороби. Натомість навколо місця інфільтрації з'явилася смуга швидко вмираючих клітин. Ця реакція, під час якої рослини жертвують локалізованим скупченням клітин, щоб стримати потенційного загарбника, відома в імунології рослин як гіперчутлива реакція (ГР). По суті, це контрольований опік: рослина знищує невелику ділянку, щоб запобігти поширенню більшої інфекції.

Що ще більше здивувало дослідників, так це те, що цей білок зберігав повну активність навіть після кип'ятіння у воді протягом 15 хвилин — надзвичайна властивість для білка.

Білок був названий гарпіном, а результати дослідження були опубліковані в журналі Science. На момент публікації ніхто не очікував, що це відкриття через три десятиліття призведе до появи глобальної сфери застосування в сільському господарстві.

Природна роль білків гарпіну

Білки гарпіну є компонентами інфекційного апарату, що використовується фітопатогенними бактеріями, але розуміння цієї ролі є ключовим для розуміння того, чому вони безпечні у використанні.

Грамнегативні патогени рослин розробили високодосконалений апарат секреції білків, відомий як система секреції III типу (T3SS). Уявіть собі його як молекулярний шприц: його основна функція полягає в безпосередньому введенні бактеріальних ефекторних білків у клітини рослин, де вони перешкоджають імунній сигналізації рослини та дозволяють патогену поширюватися.

Найбільша спільнота СуперАгрономів у Facebook

Білки гарпіну служать допоміжними білками в цій системі, а не основними агентами, що викликають хвороби. Вони секретуються в позаклітинний простір (простір поза клітиною рослини), а не переміщуються в саму клітину. Їхня роль полягає в тому, щоб допомогти ефекторним білкам пробити бар'єр плазматичної мембрани рослини за допомогою таких механізмів, як зв'язування з мембранними ліпідами, формування іонно-провідних пор та олігомеризація білків.

Саме ця позаклітинна локалізація робить гарпінові білки безпечними для сільськогосподарського використання: вони діють на зовнішній поверхні рослинних клітин, не проникають у ядро ​​рослинної клітини та не втручаються в геном рослини.

Читати також: Управління фотосинтетичною активністю рослин: чи можливо покращити урожайність

На сьогоднішній день гарпінові білки були ідентифіковані та охарактеризовані у багатьох видів фітопатогенних бактерій, включаючи HrpZ1 та HrpW1 з Pseudomonas syringae, HrpN з Erwinia amylovora та Hpa1 з Xanthomonas spp. На основі структури білкового домену вони згруповані в чотири основні родини, які разом називають гарпіновими білками.

Чому гарпінові білки корисні для рослин?

Як білок, що еволюціонував у якості частини системи бактеріальної інфекції, може мати корисні ефекти при застосуванні до рослин? Відповідь криється в логіці розпізнавання імунної системи рослин.

Протягом еволюції рослини розвинули здатність виявляти характерні молекулярні сигнатури патогенів. Коли білки гарпіну — молекули, пов'язані з бактеріальними патогенами — відчуваються поверхневими рецепторами на клітинах рослин, вони запускають каскад захисних та ростових реакцій. Логіка рослини, фактично, така: «Я виявляю цей сигнал, а це означає, що небезпека може наближатися — я зараз підготую свій захист».

Коли білки гарпіну застосовуються за відсутності будь-якого фактичного патогену, захисна реакція активується, але інфекції не виникає. Результат: імунна користь зберігається, але ймовірність інфекції дорівнює нулю.

Протягом десятиліть досліджень та різноманітних систем вирощування сільськогосподарських культур послідовно документувалися такі основні ефекти:

1. Підвищена стійкість до хвороб: індукція білків, пов'язаних з патогенезом (PR), та активація системної набутої стійкості (SAR) — версії рослини «широкого спектру імунного оновлення». У томатів було продемонстровано значне зниження захворюваності на фітофтороз та сіру гниль.
2. Стимуляція росту: прискорений розвиток коренів, покращена фотосинтетична ефективність та підвищення загальної сили росту рослин. Задокументовано на Arabidopsis, рисі, тютюні та інших культурах.
3. Стійкість до комах: арабідопсис, обробленийгарпіновими білками, продемонстрував значно підвищену стійкість до попелиці; популяції попелиці становили приблизно на третину менше, ніж у необробленому контролі, через сім днів після зараження.
4. Покращена посухостійкість: рослини рису, які надмірно експресують гени, що кодують гарпін, демонстрували вищі показники виживання та краще збереження врожаю в умовах посухи.

Карта ґрунтів

Інтерактивна карта ґрунтового покриву України

Які сигнальні шляхи активують білки гарпіну?

Ключ до розуміння гарпінових білків полягає в усвідомленні того, що вони не діють через один шлях. Вони одночасно активують кілька взаємопов'язаних сигнальних шляхів у рослині. Ця багатошляхова, багатовимірна реакція робить їхній вплив ширшим і послідовнішим, ніж у продуктів, що залежать від будь-якого єдиного механізму.

Дослідження визначають три основні категорії каналів і шляхів, що активуються гарпіновими білками:

Іонні канали

• Калієві (K⁺) канали. Гарпінові білки стимулюють випрямляючі струми K⁺ через плазматичну мембрану. Було показано, що HrpN з патогена бактеріального опіку значно активує калієві канали в клітинах Arabidopsis, змінюючи мембранний потенціал і запускаючи каскади сигнальних шляхів захисту.
• Аквапорини (білки водних каналів). Гарпіни безпосередньо взаємодіють з внутрішніми білками плазматичної мембрани (аквапоринами, такими як PIP1;4), регулюючи транспорт води та CO₂ через клітини рослин. Це модулює ефективність фотосинтезу та загальний ріст рослин — і є одним із молекулярних пояснень покращення ефективності використання води, опосередкованого гарпіном.
• Приплив іонів кальцію (Ca²⁺). Обробка гарпіном запускає позаклітинне підлужування в клітинах рослин — ранню захисну реакцію — у процесі, який залежить від припливу Ca². Дослідження показують, що блокування кальцієвих каналів пригнічує гіперчутливу реакцію, встановлюючи сигналізацію Ca²⁺ як критичний ранній вузол у ланцюзі відповіді гарпіну.

Шляхи захисту та гормональної сигналізації

• Шлях сигналізації саліцилової кислоти (SA). Це основний шлях, що лежить в основі системної набутої резистентності (SAR) — найширшого імунного механізму рослини. Гарпіни активують експресію генів NDR1 та EDS1, стимулюючи біосинтез та накопичення саліцилової кислоти, і зрештою індукуючи стійкість широкого спектру дії до різноманітних патогенів. На практиці: гарпін готує імунну систему рослини до будь-якого фактичного захворювання.
• Сигналізація активних форм кисню (ROS) та оксиду азоту (NO). Гарпіни активують ферменти RBOH та NOS, викликаючи швидкий сплеск активних форм кисню та оксиду азоту. Ці дві сигнальні молекули діють узгоджено, регулюючи інтенсивність та просторовий протяжність гіперчутливої ​​відповіді (HR) — локалізованої запрограмованої клітинної смерті, яка фізично зупиняє поширення патогена.
• Сигнальний шлях етилену (ET). Гарпіни регулюють біосинтез та накопичення етилену. Потім етилен активує транскрипційні фактори EIN2 та EIN3/EIL1, посилюючи як імунну активацію, так і реакції стимуляції росту. Мутанти етиленового шляху демонструють помітно ослаблені реакції на обробку гарпіном, що підтверджує це як центральну сигнальну вісь.
• Сигнальний шлях гібереліну (GA). Гарпіни індукують біосинтез гібереліну. Знімаючи інгібуючий ефект білків DEL, які зазвичай діють як гальма сигнального шляху GA, гарпіни сприяють подовженню клітин та загальному росту рослин. Це додаткове гормональне пояснення переваг росту, що спостерігаються в польових випробуваннях.

Інші важливі шляхи

• Каскад MAPK (Каскад протеїнкінази, активованої мітогеном). Гарпіни активують сигнальні каскади MAPK — внутрішню систему «ретрансляції повідомлень» рослини, яка перетворює позаклітинні сигнали на скоординовані реакції експресії генів всередині клітини.
• Шляхи, пов'язані з гіперчутливою реакцією (ГР). ГР, індукована гарпіном, також включає порушення мітохондріальної функції та пригнічення локального клітинного дихання — механізми, що сприяють створенню ефективного захисного бар'єру в місці інфекції.
• Регуляція транскрипції. Гарпіни індукують зміни експресії в широкому спектрі генів рослин, що охоплюють біосинтез клітинної стінки, міжклітинну комунікацію, передачу сигналів та вторинний метаболізм. Примітно, що різні білки гарпіну демонструють різні переваги шляхів: HrpZ діє переважно через іонні канали та сигналізацію SA, тоді як Hpa1 демонструє інший акцент, що вказує на те, що білки гарпіну з різних бактеріальних джерел несуть власні характерні сигнальні сигнатури.

Здатність білка гарпіну одночасно забезпечувати стимуляцію росту, стійкість до хвороб та стресостійкість випливає з сигнальної мережі, що охоплює три рівні: іонні канали, рослинні гормони та внутрішньоклітинні сигнальні каскади. Ця багатошляхова синергія є визначальною характеристикою, яка відрізняє білки гарпіну від біостимуляторів, що діють через один механізм. Коли клієнти запитують, чому гарпін забезпечує кілька переваг одночасно, відповідь така: він активує власну багатошарову систему захисту та росту рослини за одне застосування.

Незвичайні фізико-хімічні властивості білків гарпіну

Порівняно з більшістю білків, гарпінові білки демонструють кілька структурно незвичайних особливостей, і саме ці особливості надають їм функціональної універсальності та практичних переваг для формування рецептур.

• Високий вміст гліцину. Гліцин становить понад 15% від загальної кількості амінокислот у більшості гарпінових білків, що значно перевищує типові білки. Як амінокислота з найменшим бічним ланцюгом, її велика кількість створює виняткову гнучкість остова, без фіксованої, жорсткої тривимірної конформації. Ця структурна гнучкість, ймовірно, дозволяє гарпіновим білкам взаємодіяти з різноманітними компонентами мембрани та рецепторними мішенями.
• Майже повна відсутність цистеїну. Цистеїн утворює дисульфідні зв'язки, які стабілізують тривимірну структуру більшості білків. Гарпінові білки практично не містять цистеїну, що означає, що їм бракує компактної, жорстко складеної архітектури більшості білків, і саме тому їхню структуру важко передбачити обчислювально.
• Виняткова термостабільність. Гарпінові білки зберігають повну біологічну активність після кип'ятіння протягом 15 хвилин. Оскільки вони не мають чутливої ​​до температури третинної структури, яку можна втрачати, вони переносять термічну обробку набагато краще, ніж звичайні білки. Це має пряме практичне значення: спрощує промислову екстракцію та обробку рецептур на основі ферментації.
• Сильнокислий характер. Теоретична ізоелектрична точка більшості гарпінових білків знаходиться між pH 4,0 та 5,0, тобто вони несуть загальний негативний заряд при фізіологічному pH. Це впливає на їхню поведінку в апопласті рослини та їхню взаємодію з мембранними ліпідами.

Від інструменту патології до сільськогосподарської продукції

Після підтвердження лабораторної цінності білків гарпіну, комерційні розробки розпочалися наприкінці 1990-х років у Сполучених Штатах, де Eden Bioscience розробила продукт на основі гарпіну під назвою «Messenger», який отримав регуляторні реєстрації на окремих ринках.

Читати також: Міфи та правда про біостимулятори: принцип дії, робота разом з пестицидами та добривами

Однак рання комерціалізація не проходила гладко. Шлях від ферментаційної екстракції біологічно активного білка до стабільної комерційної рецептури несе потенційні втрати активності на кожному кроці. Стабільність від партії до партії, відтворюваність польової ефективності в різних географічних регіонах та інтеграція з існуючими програмами добрив та пестицидів — жодна з цих проблем не була належним чином вирішена в продуктах раннього покоління, і поглинання ринку залишалося обмеженим.

Починаючи з 2010-х років, коли ширший сектор біостимуляторів набирав обертів, а світова сільськогосподарська політика все більше наголошувала на зменшенні залежності від синтетичних добрив та пестицидів, білки гарпіну знову увійшли в поле зору агрохімічної промисловості. Нове покоління розробників принесло більш зрілі процеси ферментації, більш суворі стандарти ізоляції та характеристики, а також більш систематичні протоколи багаторазової польової валідації.

Читати також: Залежність впливу біостимуляторів на ефективність використання поживних речовин від їх походження (вмісту)

Сьогодні продукти на основі гарпінових білків, отриманих з Pseudomonas syringae (позначених як гарпіновий білок Pss), завершили або активно проходять процедуру реєстрації в регуляторних органах у багатьох країнах та регіонах, орієнтовані на овочі, польові культури та спеціальні культури в різних сільськогосподарських системах.

Джерело: Choi MS et al. Гарпіни, багатофункціональні білки, що секретуються грамнегативними фітопатогенними бактеріями. Molecular Plant-Microbe Interactions 26(10):1115–1122.

Переклад SuperAgronom.com

Світлини та відео про життя і роботу агрономів в Instagram SuperAgronom_